ปัจจัยรบกวนในปฏิกิริยา PCR

ในระหว่างปฏิกิริยา PCR มักพบปัจจัยรบกวนบางประการ
เนื่องจาก PCR มีความไวสูงมาก การปนเปื้อนจึงถือเป็นหนึ่งในปัจจัยที่สำคัญที่สุดที่ส่งผลต่อผล PCR และอาจทำให้เกิดผลบวกปลอมได้
แหล่งต่างๆ ที่นำไปสู่ผลลบเทียมก็มีความสำคัญไม่แพ้กัน หากส่วนสำคัญหนึ่งส่วนขึ้นไปของส่วนผสม PCR หรือปฏิกิริยาการขยายพันธุ์เองถูกยับยั้งหรือแทรกแซง การทดสอบวินิจฉัยก็จะหยุดชะงักได้ ซึ่งอาจส่งผลให้ประสิทธิภาพลดลงและอาจถึงขั้นให้ผลลบเทียมได้
นอกจากการยับยั้งแล้ว การสูญเสียความสมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายอาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากเงื่อนไขการขนส่งและ/หรือการจัดเก็บก่อนการเตรียมตัวอย่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง อุณหภูมิสูงหรือการจัดเก็บที่ไม่เพียงพออาจทำให้เซลล์และกรดนิวคลีอิกเสียหาย การตรึงเซลล์และเนื้อเยื่อและการฝังพาราฟินเป็นสาเหตุที่ทราบกันดีของการแตกตัวของดีเอ็นเอและปัญหาที่เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่อง (ดูรูปที่ 1 และ 2) ในกรณีเหล่านี้ การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสมที่สุดก็ไม่สามารถช่วยได้

รูปที่ 1 | ผลของการทำให้เคลื่อนที่ไม่ได้ต่อความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ
การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสด้วยเจลอะกาโรสแสดงให้เห็นว่าคุณภาพของดีเอ็นเอที่แยกได้จากส่วนพาราฟินของการชันสูตรพลิกศพนั้นแตกต่างกันอย่างมาก ดีเอ็นเอที่มีความยาวชิ้นส่วนเฉลี่ยต่างกันจะอยู่ในสารสกัดขึ้นอยู่กับวิธีการตรึง ดีเอ็นเอจะคงอยู่ได้ก็ต่อเมื่อตรึงในตัวอย่างแช่แข็งดั้งเดิมและในฟอร์มาลินที่เป็นกลางที่ผ่านบัฟเฟอร์ การใช้สารตรึง Bouin ที่มีฤทธิ์เป็นกรดเข้มข้นหรือฟอร์มาลินที่ประกอบด้วยกรดฟอร์มิกที่ไม่ได้ผ่านบัฟเฟอร์ส่งผลให้สูญเสียดีเอ็นเอไปอย่างมาก เศษส่วนที่เหลือจะแตกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยอย่างมาก
ทางด้านซ้ายความยาวของชิ้นส่วนแสดงเป็นกิโลเบสคู่ (kbp)

รูปที่ 2 | การสูญเสียความสมบูรณ์ของเป้าหมายกรดนิวคลีอิก
(ก) ช่องว่าง 3′-5′ บนสายทั้งสองจะส่งผลให้ DNA เป้าหมายขาด การสังเคราะห์ DNA จะยังคงเกิดขึ้นบนชิ้นส่วนขนาดเล็ก อย่างไรก็ตาม หากไม่มีตำแหน่งการอบอ่อนไพรเมอร์บนชิ้นส่วน DNA การขยายเชิงเส้นจะเกิดขึ้นเท่านั้น ในกรณีที่เหมาะสมที่สุด ชิ้นส่วนอาจอิ่มตัวซึ่งกันและกัน แต่ผลผลิตจะน้อยและต่ำกว่าระดับการตรวจจับ
(b) การสูญเสียเบส ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการแยกสารบริสุทธิ์และการก่อตัวของไดเมอร์ไทมิดีน ส่งผลให้จำนวนพันธะไฮโดรเจนลดลงและ Tm ลดลง ในระหว่างช่วงการอุ่นเครื่องที่ยืดออก ไพรเมอร์จะละลายออกจากดีเอ็นเอของเมทริกซ์และจะไม่เกิดการอบอ่อนแม้ภายใต้สภาวะที่ไม่เข้มงวดมากนัก
(c) เบสไทมีนที่อยู่ติดกันก่อตัวเป็นไดเมอร์ TT
ปัญหาทั่วไปอีกประการหนึ่งที่มักเกิดขึ้นในการวินิจฉัยทางโมเลกุลคือการปล่อยกรดนิวคลีอิกเป้าหมายที่ไม่เหมาะสมเมื่อเทียบกับการสกัดด้วยฟีนอล-คลอโรฟอร์ม ในกรณีร้ายแรง อาจเกี่ยวข้องกับผลลบเทียม การต้มไลซิสหรือการย่อยเศษเซลล์ด้วยเอนไซม์สามารถประหยัดเวลาได้มาก แต่บ่อยครั้งที่วิธีนี้ส่งผลให้มีความไวต่อ PCR ต่ำเนื่องจากการปล่อยกรดนิวคลีอิกไม่เพียงพอ

การยับยั้งกิจกรรมของโพลีเมอเรสในระหว่างการขยาย

โดยทั่วไป การยับยั้งใช้เป็นแนวคิดในการบรรจุเพื่ออธิบายปัจจัยทั้งหมดที่นำไปสู่ผลลัพธ์ PCR ที่ไม่เหมาะสม ในแง่ชีวเคมีโดยเคร่งครัด การยับยั้งจำกัดอยู่แค่กิจกรรมของเอนไซม์ กล่าวคือ ยับยั้งจะลดหรือป้องกันการแปลงสารตั้งต้นเป็นผลิตภัณฑ์ผ่านปฏิสัมพันธ์กับไซต์ที่ใช้งานของ DNA โพลิเมอเรสหรือโคแฟกเตอร์ของมัน (เช่น Mg2+ สำหรับ Taq DNA โพลิเมอเรส)
ส่วนประกอบในตัวอย่างหรือบัฟเฟอร์ต่างๆ และสารสกัดที่มีรีเอเจนต์สามารถยับยั้งเอนไซม์โดยตรงหรือดักจับโคแฟกเตอร์ของเอนไซม์ (เช่น EDTA) ส่งผลให้โพลิเมอเรสไม่ทำงาน ส่งผลให้ผล PCR ลดลงหรือเป็นผลลบปลอม
อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาหลายอย่างระหว่างส่วนประกอบของปฏิกิริยากับกรดนิวคลีอิกที่มีเป้าหมายยังถูกเรียกว่า "สารยับยั้ง PCR" อีกด้วย เมื่อความสมบูรณ์ของเซลล์ถูกทำลายจากการแยกและกรดนิวคลีอิกถูกปลดปล่อย ปฏิกิริยาระหว่างตัวอย่างกับสารละลายโดยรอบและเฟสแข็งอาจเกิดขึ้นได้ ตัวอย่างเช่น "สารกำจัดขยะ" สามารถจับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยวหรือสายคู่ผ่านปฏิกิริยาที่ไม่ใช่โควาเลนต์ และขัดขวางการแยกและการทำให้บริสุทธิ์โดยลดจำนวนเป้าหมายที่ไปถึงภาชนะปฏิกิริยา PCR ในที่สุด
โดยทั่วไปสารยับยั้ง PCR พบได้ในของเหลวในร่างกายส่วนใหญ่และสารเคมีที่ใช้ในการทดสอบการวินิจฉัยทางคลินิก (ยูเรียในปัสสาวะ ฮีโมโกลบินและเฮปารินในเลือด) อาหารเสริม (ส่วนประกอบอินทรีย์ ไกลโคเจน ไขมัน ไอออน Ca2+) และส่วนประกอบในสิ่งแวดล้อม (ฟีนอล โลหะหนัก)

สารยับยั้ง PCR ที่พบได้ทั่วไป ได้แก่ แบคทีเรียและเซลล์ยูคาริโอต DNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย โมเลกุลขนาดใหญ่ที่จับกับ DNA ของเมทริกซ์เนื้อเยื่อ และอุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการ เช่น ถุงมือและพลาสติก การทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกระหว่างหรือหลังการสกัดเป็นวิธีการที่ต้องการในการกำจัดสารยับยั้ง PCR
ปัจจุบัน อุปกรณ์สกัดอัตโนมัติต่างๆ สามารถแทนที่โปรโตคอลด้วยมือได้มากมาย แต่ยังไม่เคยประสบความสำเร็จในการสกัดและ/หรือทำให้เป้าหมายบริสุทธิ์ 100% สารยับยั้งที่มีศักยภาพอาจยังคงอยู่ในกรดนิวคลีอิกที่บริสุทธิ์แล้วหรืออาจออกฤทธิ์ไปแล้ว มีกลยุทธ์ต่างๆ มากมายในการลดผลกระทบของสารยับยั้ง การเลือกโพลีเมอเรสที่เหมาะสมสามารถส่งผลกระทบอย่างมากต่อกิจกรรมของสารยับยั้ง วิธีอื่นๆ ที่พิสูจน์แล้วในการลดการยับยั้ง PCR ได้แก่ การเพิ่มความเข้มข้นของโพลีเมอเรสหรือการใช้สารเติมแต่ง เช่น BSA
การยับยั้งปฏิกิริยา PCR สามารถสาธิตได้โดยการใช้การควบคุมคุณภาพกระบวนการภายใน (IPC)
ต้องระมัดระวังในการแยกสารเคมีและสารละลายอื่นๆ ในชุดสกัด เช่น เอธานอล EDTA CETAB LiCl GuSCN SDS ไอโซโพรพานอล และฟีนอล ออกจากไอโซเลตกรดนิวคลีอิกด้วยขั้นตอนการล้างอย่างละเอียด ทั้งนี้ สารเหล่านี้อาจกระตุ้นหรือยับยั้ง PCR ได้ ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสารเหล่านี้